Kalkulator Ligation

Kategori: Biologi
- 18 Julai 2025
| |

DNA Vektor

DNA Sisipan

Persediaan Reaksi Ligation

Jumlah Sisipan Disyorkan
8.3 ng
0.33 μL stok sisipan
Jumlah Vektor
50 ng
Menggunakan 1 μL stok vektor
Nisbah Sisipan:Vektor
3:1 (molar)
Optimum untuk kloning standard

Persediaan Reaksi Lengkap

Komponen Jumlah (μL) Jumlah Akhir
DNA Vektor (50 ng/μL) 1.0 50 ng
DNA Sisipan (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA Ligase Buffer 2.0 1×
T4 DNA Ligase 1.0 400 U
Air Tanpa Nuklease 15.67 Hingga 20 μL
Jumlah Volume 20.0

Petua Pengoptimuman

Berdasarkan parameter input anda, berikut adalah beberapa cadangan:

  • Untuk hujung lekat 5' dengan nisbah vektor:sisipan 1:3, inkubasi pada 16°C selama 4 jam.
  • Rawatan CIP pada vektor akan membantu mengurangkan latar belakang ligasi sendiri.
  • Jika kecekapan transformasi rendah, cuba tingkatkan nisbah sisipan:vektor kepada 5:1.
  • Untuk ligasi hujung tumpul, tingkatkan konsentrasi ligase dan panjangkan masa ligasi.
  • Inaktivasi ligase dengan haba pada 65°C selama 10 minit sebelum transformasi untuk hasil terbaik.

About DNA Ligation

  • Ligation DNA melibatkan penyambungan fragmen DNA melalui pembentukan ikatan fosfodiester.
  • T4 DNA ligase memerlukan ATP dan Mg²⁺ untuk berfungsi dengan baik (disediakan dalam buffer ligation).
  • Ligasi hujung lekat lebih berkesan daripada ligasi hujung tumpul.
  • Nisbah molar vektor:sisipan biasanya berkisar antara 1:3 hingga 1:5 untuk kloning standard.
  • Nisbah sisipan:vektor yang lebih tinggi (3:1 hingga 10:1) disyorkan untuk ligasi hujung tumpul atau sisipan yang lebih besar.
  • Dephosphorylation vektor (menggunakan CIP, SAP, dll.) mencegah ligasi sendiri vektor.
  • Sistem ligase cepat boleh mengurangkan masa ligasi kepada 5-15 minit pada suhu bilik.

Formula untuk Jumlah Insert (ng):

\[ \text{Insert ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Saiz insert dalam kb}}{\text{Saiz vector dalam kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Mole insert}}{\text{Mole vector}} \right) \]

Apa itu Kalkulator Ligation?

Kalkulator Ligation adalah alat yang membantu penyelidik menentukan jumlah yang sesuai bagi vector dan DNA insert yang diperlukan untuk reaksi ligation yang berjaya. Ligation DNA adalah langkah kritikal dalam pengklonan molekul, di mana DNA insert disambungkan kepada vector plasmid menggunakan enzim yang dipanggil DNA ligase.

Bagaimana Ia Berfungsi?

Kalkulator ini membolehkan pengguna memasukkan butiran tentang vector dan insert mereka, termasuk panjang dan kepekatan. Berdasarkan nisbah molar yang dipilih, ia mengira jumlah DNA insert yang diperlukan untuk mencapai reaksi ligation yang optimum.

Ciri-ciri Utama

  • Mengira nisbah molar vector kepada insert untuk pelbagai senario pengklonan.
  • Menyokong kedua-dua nisbah molar standard dan khusus.
  • Memberikan cadangan untuk syarat ligation berdasarkan pengklonan hujung melekit atau tumpul.
  • Termasuk petua pengoptimuman untuk meningkatkan kecekapan ligation.

Bagaimana Menggunakan Kalkulator

  1. Masukkan panjang vector (bp) dan kepekatan (ng/μL).
  2. Masukkan panjang insert (bp) dan kepekatan (ng/μL).
  3. Pilih nisbah molar vector kepada insert yang diingini (contoh, 1:3, 1:5).
  4. Tentukan jumlah keseluruhan reaksi (contoh, 20 μL).
  5. Untuk tetapan lanjutan, pilih suhu ligation, tempoh, jenis ligase, dan pilihan rawatan vector.
  6. Klik “Kira” untuk menghasilkan jumlah insert yang disyorkan dan penyediaan reaksi.

Soalan Lazim

Apa itu nisbah molar vector kepada insert yang optimum?

Untuk ligation hujung melekit, nisbah vector kepada insert 1:3 atau 1:5 biasanya disyorkan. Untuk ligation hujung tumpul, nisbah yang lebih tinggi (contoh, 1:5 hingga 1:10) mungkin meningkatkan kecekapan.

Kenapa dephosphorylation vector disyorkan?

Dephosphorylation (menggunakan CIP, SAP, atau Phosphatase Antartika) menghalang ligation sendiri vector, mengurangkan koloni latar belakang yang tidak diingini.

Apa syarat ligation yang harus saya gunakan?

  • 16°C selama 4 jam – Syarat standard untuk T4 DNA ligase.
  • Suhu bilik selama 15 minit – Sesuai untuk Quick Ligase.
  • Semalaman pada 16°C – Disyorkan untuk ligation yang mencabar atau pengklonan hujung tumpul.

Bagaimana saya boleh meningkatkan kecekapan ligation?

  • Pastikan nisbah molar yang betul untuk vector dan insert.
  • Gunakan DNA ligase dan buffer yang segar.
  • Optimumkan syarat ligation (suhu dan tempoh).
  • Pastikan kehadiran insert melalui elektroforesis gel sebelum ligation.

Kenapa Menggunakan Kalkulator Ini?

Kalkulator Ligation ini memudahkan penyediaan reaksi ligation DNA, membantu penyelidik menentukan jumlah yang betul bagi vector dan insert untuk pengklonan yang berkesan. Dengan mengautomasikan pengiraan dan menawarkan petua pengoptimuman, ia menjimatkan masa dan meningkatkan kadar kejayaan eksperimen ligation.